前置知识

RNA是一种很容易降解的物质，由于RNA是单链结构，且生活环境中RNA酶无处不在，因而我们在实验室提取RNA时要格外小心，应全程无RNase环境中操作，并佩戴好口罩、手套等。

在这里将介绍两种实验室提取RNA的常用方法，并给各位小伙伴们提供一些小tips，欢迎大家一起讨论学习。

RNA提取的常用方法

实验室常用的提取动植物组织、细胞RNA的方法：一是比较传统的需要添加氯仿的RNA提取试剂，这里以Thermo Fisher 公司的Invitrogen TRIzol试剂为例（后文简称“TRIzol法”），由于氯仿是剧毒易挥发的危化品，现在也有许多产品是免除氯仿的RNA提取试剂，这里以Vazyme公司的FreeZol Reagent为例（后文简称“FreeZol法”）。

上述的两种方法的基本原理均是使用单相裂解试剂进行RNA提取，该方法中，生物样品被异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液所破坏而裂解，然后加入氯仿（或溴氯丙烷），混匀后离心，匀浆被分离成水相和有机相，RNA仅存在于上层水相，而DNA处于水相和有机相的分界处，变性蛋白存在于下层有机相。

回收水相后，通过加入异丙醇沉淀RNA。

如果需要提取DNA和蛋白质，可以通过顺序沉淀分离：中间相用乙醇沉淀得到DNA，从有机相中用异丙醇沉淀获得蛋白质；

从中间相回收的DNA为20kb大小，可用做PCR的模板；然而由于暴露于胍盐，蛋白质是变性的，因此主要用于免疫印迹。

实验操作实例

接下来以果蝇成虫为例详细介绍两种方法的步骤

样本处理：

A. 组织样本

1.将新鲜组织用液氮速冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显可见颗粒)。

▲研磨不彻底会影响RNA的得率和质量。

2. 将研磨成粉的样品转移至离心管中，大约每50 mg组织加入1mL TRIzol （500μL FreeZol Reagent）, 涡旋振荡至充分裂解，室温静置5 min。

▲每500μL FreeZol Reagent最多可裂解50 mg动物/植物组织，过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。肝脏、脾脏、肾脏等组织DNA/RNA含量丰富，过多样本量还会导致gDNA残留或产量降低。

▲若没有条件用液氮研磨，可将新鲜组织尽量剪碎浸泡在单相裂解试剂中，用电动匀浆器高速匀浆至组织块彻底裂解（这里我使用手动研杵研碎，手动研磨时应注意避免局部积热，尽量在冰上进行）。

3. (可选)11,200 rpm(12,000 x g)室温离心5 min。小心吸取上清至新的1.5 ml离心管，切勿吸取沉淀。

▲若样本含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌纤维、植物块茎等，可离心去除不溶物质，离心得到的沉淀包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清中。提取脂肪含量较高的组织样本时，若上层含有大量油脂，应去除。转移上清进行后续操作。

B. 悬浮细胞样本

1.离心收集细胞，弃尽上清，每1×105~1×107个细胞加入1mL TRIzol （500μL FreeZol Reagent）。

2.涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。

▲对于冻存细胞，加入FreeZol Reagent应立即进行振荡,否则会导致裂解不充分。

C. 贴壁细胞样本

1.弃去细胞培养液，用1×PBS清洗一次，弃尽废液。

2.常规6孔板每孔或直径3.5 cm平皿(约10 cm2培养面积)的细胞加入500μL FreeZol Reagent,每100mm平皿加入1mL TRIzol，使之充分覆盖到细胞表面，然后用移液器反复吹打细胞使其脱落。

▲对于贴壁牢固的细胞(细胞团)可采用细胞刮或者洁净的枪头剥离，或增加单相裂解试剂的用量，亦可在加入单相裂解试剂之前采用胰酶将细胞消化下来，然后按照悬浮细胞处理。

3.将裂解液转移至1.5 ml离心管，涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。

▲浸在TRIzol试剂中的样本可以在-60~-80°C存放至少一个月

TRIzol法提取RNA

1. 孵育匀浆样品，室温5min，以完全裂解核蛋白复合物；

2. 每毫升TRIzol加入0.2mL氯仿；盖紧管盖用力摇动15s，并在室温下孵育2-3min；

▲不要涡旋样品，因为它会导致DNA污染。

▲注意使溶液充分混匀为均一溶液，混匀不彻底影响RNA提取效率和杂质去除效率。

3. 4°C，12000g 离心15min，混合物分为三相，RNA仅存于上层水相；

4. 小心地将上层水相转移至新Ep管内，注意不要扰动中间层；

▲每1mL TRIzol可获得约600μL水相，为防止DNA污染推荐只回收500μL。

5. 每毫升TRIzol加入0.5mL异丙醇沉淀RNA，颠倒混匀，室温孵育10min；

▲注意使溶液充分混匀为均一溶液，混匀不彻底将无法使RNA沉淀。

▲低浓度样品中回收RNA时效率很低，可以在此步加入1μL糖原（20mg/mL）。

▲为防止温度过高使RNA降解，也可以置于冰上、-20°C冰箱中进行沉淀。

6. 12000g离心10min，收集RNA沉淀；

7. 弃上清，并用吸头完全去除残留液体；

8. 用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀，每毫升TRIzol加入至少1mL 75%乙醇，涡旋混合样品液，然后在4°C 7500g离心5min；重复清洗一次；

▲沉淀于75%乙醇的RNA可储存在2~8°C至少一周，-5~-80°C至少一年。

9. 完全去除乙醇，空气干燥或真空干燥RNA沉淀10min；

▲除去乙醇后，沉淀应该是半透明的，在干燥时，沉淀将变成透明凝胶体状。不要真空离心干燥的RNA。重要的是不要让RNA沉淀完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。

10. 用20~100μL的RNase free水溶解RNA，反复吹打几次。

▲部分方案中建议在55-60°C温育10min，这里我个人不建议进行加热；若RNA过于干燥，可在40°C温育直至其完全溶解。

FreeZol法提取RNA

1.向孵育匀浆样品中加入Dilution Buffer。（动植物组织:每500μL FreeZol Reagent加入100μL Dilution Buffer；细胞:每500μL FreeZol Reagen加入150μL Dilution Buffer。）盖紧离心管盖，涡旋振荡至溶液充分混匀，室温静置5 min。

▲振荡时注意使溶液充分混匀为均一溶液，混匀不彻底影响RNA提取效率和杂质去除效率。

2. 12,000g室温离心15 min。

3.小心取出离心管。此时样本中蛋白质、DNA、多糖等杂质沉淀到管底，RNA分布在上层溶液中，小心吸取上清溶液(约500μL)至一个新的离心管中。

▲上层溶液的体积约占总体积的90%，用500μL FreeZol Reagent进行提取，上层溶液约为550μL ;吸到下层沉淀会导致基因组及杂质污染。

▲部分样本上清轻微浑浊或有颜色，可继续后续操作，不影响产量和纯度。

▲组织投入量为50 mg时，吸取上清溶液体积建议减少至450μL ,防止吸到下层沉淀。

4.在得到的上清溶液中加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10 min。

5. 12,000g室温离心10 min,离心后在管侧和管底可以看见白色凝胶状沉淀，小心弃去上清，勿丢失沉淀。

▲RNA含量少会导致沉淀不明显，小心弃去上清，勿丢失沉淀。

▲部分特殊样本如:水稻叶RNA沉淀会分散在离心管壁上导致白色沉淀不明显，小心弃去上清,步骤7离心后沉淀可见。

▲为减少杂质残留，此步骤尽可能将上清弃干净，勿丢失沉淀。

6.加入1 ml 75%乙醇。轻弹管底，让沉淀悬浮起来，并上下颠倒数次。

7. 8,000 g室温离心3 min,弃去上清，勿丢失沉淀。

8.重复步骤6和7一遍，弃尽上清。

▲为减少杂质残留，应尽可能的将上清液弃干净。建议弃去大部分上清后，短暂离心将所有液体甩至管底，再用移液器将剩余液体吸掉，注意不要吸到沉淀。

9.室温放置晾干，加入20- 100μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，室温涡旋3 min(或使用移液器反复吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA产物可以分装后在-85 ~ -65°C长期保存，在-30 ~-15°C短期保存。

▲通常，RNA沉淀晾干2 - 3 min即可，不要过度晾干，RNA完全干燥后会很难溶解。

▲RNA产物需要充分溶解，否则可能导致浓度定量失准。

RNA质量分析

使用超微量紫外分光光度计，测量提取RNA样品的A230、A260、A280，用来计算RNA样品的浓度、估计RNA纯度。

计算溶液中RNA浓度的公式：RNA样品浓度（μg/mL）= A260×40×稀释倍数

A260不能区分RNA和DNA，因此，建议用无RNase的DNase处理RNA样品去除DNA污染。

此外，污染物如苯酚和蛋白质会影A260的读数; 苯酚在波长为260nm处有强烈的吸收,而芳香族氨基酸的吸收在280nm处。

在260nm处吸光度相对于280nm的吸光度比值( A260/A280)可以用来评估RNA样品中蛋白质的污染水平。纯的RNA的A260/A=值接近2.0。

如果有明显的蛋白质或酚污染，A260/A280 比小于2.0，用紫外分光光度法将不可能准确定量核酸含量。

另一个比值A260/A230可用于评估有机化合物或高离液盐( chaotropic salt)的污染水平，它们在波长230nm处有强烈吸收，导致低A260/A230。

理想情况下，提取RNA的A260/A230的比例应接近2.0。

▲A260/A280 比值依赖于pH和离子强度。随着pH的增加，A280 降低, 但A260 不受影响，从而A260/A280的比值增加。因为纯水pH为酸性，如果使用它们溶解RNA, A260/A280的比值可能偏低。因此为了准确的可重复的读数，最好使用缓冲液如TE (pH 8.0)作为稀释剂和空白对照。

琼脂糖凝胶电泳分析：

提取的RNA质量优劣可以通过简单的非变性琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用MOPS或TBE缓冲液、配制0.8%琼脂糖凝胶，在4~5V/cm电压下进行电泳，若RNA纯度较好将会有清晰的三（四）条带（28S、18S、5.8/5S）且亮度均一（上样质量一样）。

常见问题&解决方案

参考资料：https://www.technologynetworks.com/biopharma/blog/addressing-rna-research-challenges-366380